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引言
生物流體(如血液、尿液、唾液等)中細(xì)菌的存在與人類(lèi)生活和公共健康密切相關(guān)。在疾病初期及時(shí)、準(zhǔn)確鑒定致病菌種類(lèi)對(duì)確認(rèn)致病菌感染源和阻止疾病傳播至關(guān)重要。傳統(tǒng)細(xì)菌檢測(cè)方法有平板計(jì)數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISAs)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCRs)等,這些技術(shù)雖然促進(jìn)了細(xì)菌檢測(cè)的發(fā)展,但仍存在耗時(shí)長(zhǎng)、勞動(dòng)密集、實(shí)驗(yàn)成本高等不足。雙重酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)具備更低的活性位點(diǎn),傳質(zhì)速度快、反應(yīng)效率高等優(yōu)勢(shì),近年來(lái)被越來(lái)越多的用于生物傳感檢測(cè)領(lǐng)域。
近期,南京師范大學(xué)王琛教授課題組采用一步還原法制備了雙重酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)Au@POM 納米顆粒子,實(shí)驗(yàn)采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為模型,以可見(jiàn)光波段光譜吸收強(qiáng)度為依據(jù),分析細(xì)菌代謝過(guò)程中葡萄糖濃度與細(xì)菌代謝速度關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明,Au@POM納米酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)在細(xì)菌含量為1-7.5 x 107 CFU mL-1呈線(xiàn)性關(guān)系,檢測(cè)限為5 CFU mL-1。
結(jié)果分析
納米酶級(jí)聯(lián)催化的細(xì)菌檢測(cè)原理如圖1所示,采用一步還原法制備Au@POM 納米顆粒,金屬氧酸鹽(POMs)為殼、金納米粒子(AuNPs)為核。金納米顆粒(AuNPs)具備葡萄糖氧化酶(GOx)活性,金屬氧酸鹽(POMs)具備過(guò)氧化物酶(HRP)活性,制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)采用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型,在細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中需要消耗葡萄糖能源,理論上葡萄糖含量越高,細(xì)菌含量越低,因此可將葡萄糖含量與細(xì)菌含量的線(xiàn)性關(guān)系作為細(xì)菌定量分析的可行性策略。首先,AuNPs的葡萄糖氧化酶活性將葡萄糖底物氧化為葡萄糖酸,并產(chǎn)生H2O2,然后,利用POMs的過(guò)氧化物酶活性,將3’,3’5’,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)氧化為T(mén)MB+,形成強(qiáng)可見(jiàn)光吸收峰。
圖1納米酶級(jí)聯(lián)催化的細(xì)菌檢測(cè)原理示意圖。(A) 一步還原法制備Au@POM(B) 級(jí)聯(lián)催化Au@POM納米酶。(C) 細(xì)菌在代謝過(guò)程(D)細(xì)菌/無(wú)細(xì)菌生物體系中可見(jiàn)光吸收強(qiáng)度。
圖2 (A) Au@POM 納米顆粒TEM圖像,顆粒直徑15nm,Au核的POM薄層厚約1nm;(B)SEM圖和EDS圖譜;(C)納米顆粒ζ電位圖;(D)不同材料XRD圖;(E)Au與Au@POM的可見(jiàn)光吸收譜,介電常數(shù)改變導(dǎo)致Au@POM紅移
圖3 (A)不同體系可見(jiàn)光吸收光譜;(B)Au@POMs + Glu + TMB納米酶級(jí)聯(lián)催化體系可見(jiàn)光吸收譜峰與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系;(C)對(duì)葡萄糖濃度做Michaelis–Menten模型的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)測(cè)定(TMB濃度為1.2mM);(D)納米酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的雙倒數(shù)圖
實(shí)驗(yàn)時(shí)采用金黃色葡萄球菌作為模型,隨著細(xì)菌含量增加,吸收峰強(qiáng)度明顯降低,在濃度為10-1x107 CFU mL-1區(qū)間,細(xì)菌含量與吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,金黃色葡萄球菌檢測(cè)限為5 CFU mL-1。作者同步做大腸桿菌對(duì)比實(shí)驗(yàn),其吸光度強(qiáng)度隨細(xì)菌濃度變化趨勢(shì)與金黃色葡萄球菌相似,結(jié)果表明Au@POMs納米酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)具有良好的普適性。
圖4 (A)納米酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)細(xì)菌檢測(cè)原理示意圖;(B)不同尺寸金黃色葡萄球菌的暗場(chǎng)視野圖像(0,10,102-107 CFU·mL-1);(C)加入不同含量細(xì)菌后的可見(jiàn)光吸收光譜圖;(D)人體血清樣品和PBS緩沖液的細(xì)菌檢測(cè)
結(jié)論
本文采用一步還原法合成納米酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)Au@POMs納米顆粒,該體系制備的Au@POM 納米顆粒具備雙重酶活性,以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為模型,采用暗場(chǎng)顯微鏡直接觀測(cè)細(xì)菌形貌,并通過(guò)不同細(xì)菌模型的可見(jiàn)光吸收光譜進(jìn)行細(xì)菌濃度的半定量分析。結(jié)果表明,細(xì)菌含量與可見(jiàn)光吸收強(qiáng)度具備良好的線(xiàn)性關(guān)系。將金黃色葡萄球菌摻入10%血清中,結(jié)果與在PBS緩沖液中結(jié)果相似,表明該方法在真實(shí)樣品檢測(cè)中具備潛在應(yīng)用,為高靈敏度實(shí)施細(xì)菌檢測(cè)提供了有力工具。
南京師范大學(xué)王琛教授課題組簡(jiǎn)介
王琛,南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授,博士生導(dǎo)師,國(guó)家* *青年科學(xué)基金獲得者(2020年),江蘇省“青藍(lán)工程”**青年骨干教師、中青年學(xué)術(shù)帶頭人,南京師范大學(xué)中青年領(lǐng)軍人才;南京師范大學(xué)本科、碩士,2011年博士畢業(yè)于南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2012-2016南京大學(xué)從事物理學(xué)博士后,2016-2017年麻省理工學(xué)院(MIT,美國(guó))訪(fǎng)問(wèn)學(xué)者。至今,在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文60 余篇;參編英文圖書(shū) 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley);主持多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)、江蘇省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目;擔(dān)任Chinese Chemical Letters期刊編委,中國(guó)分析測(cè)試協(xié)會(huì)青年學(xué)術(shù)委員會(huì)委員,江蘇省材料學(xué)會(huì)副秘書(shū)長(zhǎng)。
文章信息
本文以“Nanozyme-catalyzed cascade reaction enables a highly sensitive detection of live bacteria”為題發(fā)表在Journal of Materials Chemistry B上,中國(guó)藥科大學(xué)柳文媛教授和南京師范大學(xué)王琛教授為通訊作者。
本研究暗場(chǎng)顯微圖像使用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀,如需了解該產(chǎn)品,歡迎咨詢(xún)。
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